无内毒素质粒大量提取试剂盒


本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法,及硅胶膜吸附技术,可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒 DNA

  • 商品名称: 无内毒素质粒大量提取试剂盒
  • 产品货号: 04.10011-10
  • 品牌: EallBio/亿奥邦
  • 储存条件: 10~25℃
  • 有效期: 12个月

所属分类:

核酸提取/纯化系列

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¥ 1347

市场价

¥ 1347

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  • 产品描述
    • 商品名称: 无内毒素质粒大量提取试剂盒
    • 产品货号: 04.10011-10
    • 品牌: EallBio/亿奥邦
    • 储存条件: 10~25℃
    • 有效期: 12个月

    本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法,及硅胶膜吸附技术,可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒 DNA

    产品简介 

    本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法及硅胶膜吸附技术,可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒DNA;柱上直接去除内毒素,操作简便。所得质粒可直接用于细胞转染、酶切、连接、转化、PCR、测序等分子生物学实验。高拷贝质粒,100 mL菌液通常可获得500~1500 ug质粒,低拷贝质粒,200 mL菌液通常可获得200~600 ug质粒。从简便性、得率及纯度综合评价,本试剂盒优于市面上常见品牌。

    产品特点

    1. 操作简便:柱上快速去除内毒素,其他步骤亦简便高效;
    2. 纯度高:沉淀致密,去杂干净;
    3. 颜色指示:关键步骤颜色变化指示判断。

    适用范围

    本品适用于从100 mL~200 mL细菌培养物中提取多至1500 ug的高纯度无内毒素的质粒DNA。

    注意事项

    1. 细菌培养时间一般为12~16 h,如接种量大则应减少培养时间,过度培养会降低质粒质量甚至导致突变;
    2. 每次使用时需观察Buffer II和Buffer III是否形成沉淀,如有沉淀于37℃溶解后使用;
    3. 用平衡液处理过的柱子建议立即使用,放置时间过长影响使用效果;
    4. 第一次使用前,按照瓶上标签向Buffer W1中加入180 mL无水乙醇;
    5. Buffer I加入RNase A后置于2~8℃保存;
    6. 各溶液使用后请立即盖紧盖子;
    7. 所有操作均在室温下进行;
    8. 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。

    使用方法

    自备:无水乙醇、异丙醇、50 mL离心管。

    1. 柱平衡:向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入2.5 mL的平衡液Buffer BL(当天处理),10,000 rpm离心2 min,弃去收集管中滤液,将吸附柱重新放回收集管中;
    2. 取100~200 mL(对于高拷贝质粒,建议100 mL菌液;对于低拷贝质粒,建议200 mL菌液,最高不超过300 mL菌液)过夜培养的菌液,10,000 rpm 离心2 min,弃上清;
    3. 加入10 mL Buffer I使用前将试剂盒提供的RNase A全部加入,旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀,呈现出均匀混浊的棕红色;

    注意:确保菌体沉淀悬浮均匀,含未悬浮菌块会影响裂解,导致提取质粒的浓度及纯度降低。 

    1. 加入10 mL Buffer II,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直至溶液变成清亮、粘稠的紫红色;

    注意:不可剧烈震荡,以免造成基因组DNA的污染;所用时间不要超过5 min,以免质粒受到破坏,如未完全变得清亮,可能是菌体太多,可增加Buffer II的用量,在后续的操作中按倍数增加Buffer III的用量

    1. 加入10 mL Buffer III,立即温和颠倒混匀,可见红黄相间的絮状物产生,继续混匀直至完全变为黄色。10,000 rpm离心10 min,小心将上清转移至干净离心管(自备)中不要带入沉淀

    注意:

    1)Buffer III加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如果上清中还有紫色漂浮物,说明复性不充分,继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色

    1. 离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜,注意不要倒入吸附柱
    2. 如果实验室采用吊篮式离心机,不是固定转子,转速达不到10000 rpm,可以采用吊篮离心的最大转速4250 g,离心10 min。
    1. 加入0.3倍滤液体积的异丙醇,颠倒混匀(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)
    2. 将步骤6所得混合溶液转移到平衡好的吸附柱EC (with Collection Tubes)中,10,000 rpm离心1 min,弃收集管中的滤液吸附柱最大容积为15 mL,即上步中所得溶液需分2~3次过柱

    注意:如果离心机转子倾角较大时,建议加入吸附柱的溶液体积不超10 mL,以防漏液。 

    1. 向吸附柱EC中加入5 mL Endotoxin Removal Buffer,静置5 min,10,000 rpm离心1 min,弃滤液;
    2. 加入10 mL Buffer W1(使用前检查是否已加入无水乙醇),10,000 rpm离心1 min,弃滤液;
    3. 加入5 mL Buffer W1,10,000 rpm离心1 min,弃滤液;
    4. 将吸附柱EC放回空收集管中,10,000 rpm离心5 min;
    5. 将吸附柱EC置于新的50 mL离心管中,开盖放置5 min,彻底挥发乙醇;
    6. 在吸附膜的中间部位加入1~2 mL洗脱液Buffer EB(60~65℃预热效果更好),常温放置2 min,10,000 rpm离心2 min,即得质粒DNA(如需较多量DNA,可将得到的溶液重新转入吸附柱,重复此步骤

    常见问题与解决办法

    Q1:质粒DNA产量低?

    A1:

    1. 质粒拷贝数低、质粒>10 kb或革兰氏阳性菌质粒。应加大菌体使用量,可使用300~500 mL过夜培养物,洗脱液Buffer EB 60℃水浴预热,吸附和洗脱时间可以适当延长,以增加提取效率;
    2. 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象,培养细菌前建议先划线活化,以稳定产量;
    3. 细菌未充分裂解。细菌须在Buffer I/RNase A中充分重悬或菌体不宜过多,避免成团或过量的细菌无法裂解降低产量。

    Q2:质粒DNA中有基因组DNA污染?

    A2:

    1. 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在12~16 h;
    2. 裂解问题。加入Buffer II时,必须轻柔颠倒混匀;处理多个样品时,从加入Buffer II时算起,总时间不要超过5 min。

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