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产品简介
本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法及硅胶膜吸附技术，可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒DNA；柱上直接去除内毒素，操作简便。所得质粒可直接用于细胞转染、酶切、连接、转化、PCR、测序等分子生物学实验。高拷贝质粒，100 mL菌液通常可获得500~1500 ug质粒，低拷贝质粒，200 mL菌液通常可获得200~600 ug质粒。从简便性、得率及纯度综合评价，本试剂盒优于市面上常见品牌。
产品特点
l 操作简便：柱上快速去除内毒素，其他步骤亦简便高效；
l 纯度高：沉淀致密，去杂干净；
l 颜色指示：关键步骤颜色变化指示判断。
适用范围
本品适用于从100 mL~200 mL细菌培养物中提取多至1500 ug的高纯度无内毒素的质粒DNA。
注意事项
1.细菌培养时间一般为12~16 h，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致突变；
2.每次使用时需观察Buffer II和Buffer III是否形成沉淀，如有沉淀于37℃溶解后使用；
3.用平衡液处理过的柱子建议立即使用，放置时间过长影响使用效果；
4.第一次使用前，按照瓶上标签向Buffer W1中加入180 mL无水乙醇；
5.Buffer I加入RNase A后置于2~8℃保存；
6.各溶液使用后请立即盖紧盖子；
7.所有操作均在室温下进行；
8.质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。
使用方法
自备：无水乙醇、异丙醇、50 mL离心管。
1.柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入2.5 mL的平衡液Buffer BL（当天处理），10,000 rpm离心2 min，弃去收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中；
2.取100~200 mL（对于高拷贝质粒，建议100 mL菌液；对于低拷贝质粒，建议200 mL菌液，最高不超过300 mL菌液）过夜培养的菌液，10,000 rpm 离心2 min，弃上清；
3.加入10 mL Buffer I（使用前将试剂盒提供的RNase A全部加入），旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀，呈现出均匀混浊的棕红色；
注意：确保菌体沉淀悬浮均匀，含未悬浮菌块会影响裂解，导致提取质粒的浓度及纯度降低。
4.加入10 mL Buffer II，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直至溶液变成清亮、粘稠的紫红色；
注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA的污染；所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer II的用量，在后续的操作中按倍数增加Buffer III的用量。
5.加入10 mL Buffer III，立即温和颠倒混匀，可见红黄相间的絮状物产生，继续混匀直至完全变为黄色。10,000 rpm离心10 min，小心将上清转移至干净离心管（自备）中（不要带入沉淀）；
注意：
1）Buffer III加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有紫色漂浮物，说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色；
- 离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜，注意不要倒入吸附柱；
- 如果实验室采用吊篮式离心机，不是固定转子，转速达不到10000 rpm，可以采用吊篮离心的最大转速4250 g，离心10 min。
6.加入0.3倍滤液体积的异丙醇，颠倒混匀（加入异丙醇过多容易导致RNA污染）；
7.将步骤6所得混合溶液转移到平衡好的吸附柱EC (with Collection Tubes)中，10,000 rpm离心1 min，弃收集管中的滤液（吸附柱最大容积为15 mL，即上步中所得溶液需分2~3次过柱）；
注意：如果离心机转子倾角较大时，建议加入吸附柱的溶液体积不超10 mL，以防漏液。
8.向吸附柱EC中加入5 mL Endotoxin Removal Buffer，静置5 min，10,000 rpm离心1 min，弃滤液；
9.加入10 mL Buffer W1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm离心1 min，弃滤液；
10.加入5 mL Buffer W1，10,000 rpm离心1 min，弃滤液；
11.将吸附柱EC放回空收集管中，10,000 rpm离心5 min；
12.将吸附柱EC置于新的50 mL离心管中，开盖放置5 min，彻底挥发乙醇；
13.在吸附膜的中间部位加入1~2 mL洗脱液Buffer EB（60~65℃预热效果更好），常温放置2 min，10,000 rpm离心2 min，即得质粒DNA（如需较多量DNA，可将得到的溶液重新转入吸附柱，重复此步骤）。
常见问题与解决办法
Q1：质粒DNA产量低？
A1：
1) 质粒拷贝数低、质粒>10 kb或革兰氏阳性菌质粒。应加大菌体使用量，可使用300~500 mL过夜培养物，洗脱液Buffer EB 60℃水浴预热，吸附和洗脱时间可以适当延长，以增加提取效率；
2) 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前建议先划线活化，以稳定产量；
3) 细菌未充分裂解。细菌须在Buffer I/RNase A中充分重悬或菌体不宜过多，避免成团或过量的细菌无法裂解降低产量。
Q2：质粒DNA中有基因组DNA污染？
A2：
1) 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在12~16 h；
2) 裂解问题。加入Buffer II时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入Buffer II时算起，总时间不要超过5 min。
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