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产品简介
本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法及硅胶膜吸附技术，可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒
DNA；独特的内毒素沉淀技术，无需过滤，操作简便。本试剂盒适用于从 5~15 mL 过夜培养的细菌培养物中提取质粒，所得质粒可直接用于细胞转染、酶切、连接、转化、PCR、测序等分子生物学实验。
产品特点
l 高纯度：采用独特的内毒素沉淀技术，特异的去除内毒素
l 高效转染：适合包括内毒素敏感细胞在内的绝大多数细胞的转染
l 操作简便：采用吸附柱技术特异吸附质粒，无需过滤，操作更为简便
l 应用广泛：动植物细胞转染、分子生物学实验均可应用
适用范围
本品适用于从 5~15 mL 细菌培养物中提取高纯度无内毒素的质粒 DNA。
注意事项
1. 细菌培养时间一般为 12~16 h，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致突变；
2. 每次使用时需观察 Buffer P2 和 Buffer P4 是否形成沉淀，如有沉淀于 37 ℃溶解后使用；
3. 用平衡液处理过的柱子建议立即使用，放置时间过长影响使用效果；
4. 第一次使用前，按照瓶上标签向 Buffer W1 中加入 60 mL 无水乙醇；
5. Buffer P1 加入 RNase A 后置于 2~8℃保存；
6. 各溶液使用后请立即盖紧盖子；
7. 所有操作均在室温下进行；
8. 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。
使用方法
自备：无水乙醇、异丙醇、2 mL离心管。
1. 柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 500 μL的平衡液 Buffer BL（当天处理），12,000 rpm（~13,400×g)离心1 min，弃去收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中；
2. 取 5~15 mL 过夜培养的菌液，12,000 rpm（~13,400×g) 离心 1 min，弃上清；
3. 加入 500 μL Buffer P1（使用前将试剂盒提供的 RNase A 全部加入），旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀；
注意：确保菌体沉淀悬浮均匀，含未悬浮菌块会影响裂解，导致提取质粒的浓度及纯度降低。
4. 加入 500 μL Buffer P2，温和颠倒混匀使菌体完全裂解；
注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 的污染；所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，请减少菌体使用量。
5. 加入 500 μL Buffer P4，立即温和颠倒混匀，至溶液出现白色絮状物。12,000 rpm（~13,400×g)离心 10 min，使白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），小心将上清液转移至干净离心
管（自备）中（不要带入沉淀）；
注意：
1）Buffer P4 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀；
2）离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜，注意不要倒入吸附柱；
6. 加入 150 μL Endotoxin Removal Buffer，颠倒混匀；
7. 加入 0.3 倍上述上清液体积的异丙醇，颠倒混匀（加入异丙醇过多容易导致 RNA 污染）；
8. 将步骤 7 所得混合溶液转移到平衡好的吸附柱 EC (with Collection Tubes，吸附柱最大容积为700 μL，所得溶液需分次过柱)中，12,000 rpm（~13,400×g)离心 1 min，弃收集管中的滤液；
9. 向吸附柱中加入 600 μL Buffer W1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400
×g)离心 1 min，弃滤液；
10. 重复步骤 9；
11. 将吸附柱 EC 放回空收集管中，12,000 rpm（~13,400×g)离心 2 min；
12. 将吸附柱 EC 置于新的 2 mL 离心管中，开盖放置 5 min，彻底挥发乙醇；
13. 在吸附膜的中间部位加入 100~300 μL 洗脱液 Elution Buffer（60~65℃预热效果更好），常温放置 2 min，12,000 rpm 离心 1 min，即得质粒 DNA（如需较多量 DNA，可将得到的溶液重新转入吸附柱，重复此步骤）。
常见问题与解决办法
Q1：质粒 DNA 产量低？
A1：
1) 质粒拷贝数低、质粒>10 kb 或革兰氏阳性菌质粒。应加大菌体使用量，洗脱液 Elution Buffer 60 ℃水浴预热，吸附和洗脱时间可以适当延长，以增加提取效率；
2) 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前建议先划线活化，以稳定产量；
3) 细菌未充分裂解。细菌须在 Buffer P1/RNase A 中充分重悬或菌体不宜过多，避免成团或过量的细菌无法裂解降低产量。
Q2：质粒 DNA 中有基因组 DNA 污染？
A2：
1) 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在 12~16 h；
2) 裂解问题。加入 Buffer P2 时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入 Buffer P2 时算起，总时间不要超过 5 min。
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