UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR(with dsDNase)


快速高效的RT-PCR预混液,50℃反应,含DNase和RNase抑制剂,基因组去除和逆转录反应可一步进行,零投诉率

  • 商品名称: UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR(with dsDNase)
  • 产品货号: 04.11400
  • 品牌: EallBio/亿奥邦
  • 储存条件: -20℃
  • 有效期: 12个月

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逆转录系列

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  • 产品描述
    • 商品名称: UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR(with dsDNase)
    • 产品货号: 04.11400
    • 品牌: EallBio/亿奥邦
    • 储存条件: -20℃
    • 有效期: 12个月

    快速高效的RT-PCR预混液,50℃反应,含DNase和RNase抑制剂,基因组去除和逆转录反应可一步进行,零投诉率

    产品简介

    本产品是一款高效、便捷的第一链cDNA合成试剂,UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix中包含UnionScript Reverse Transcriptase及其反应Buffer、Rnasin、dNTPs、Oligo(dT)20VN和随机引物等第一链cDNA合成所需的所有组分,仅需加入RNA模板和水即可进行逆转录反应。

    本产品中包含的UnionScript Reverse Transcriptase是新一代逆转录酶,50℃反应,热稳定性强、逆转录效率高。dsDNase可有效去除RNA模板中残留的基因组DNA,保证后续定量结果更加可靠, qPCR引物无需跨内含子设计。使用本产品逆转录得到的cDNA可用于下游qPCR检测。

    产品特点

    • 简便快捷:基因组去除与逆转录可一步/两步完成。仅需加入RNA模板和水即可进行逆转录反应;
    • 热稳定性强:50℃反应,提高了RNA模板复杂二级结构的逆转录效率;
    • 逆转录效率高:与市面上同类产品对比,本产品的逆转录效率更高。

    适用范围

    本产品适用于动物、植物及微生物RNA模板的第一链cDNA合成反应,经本产品逆转录得到的产物可兼容下游的染料法qPCR检测和探针法qPCR检测。

    注意事项

    1.预混液中包含有Oligo(dT)20VN和随机引物,不仅适用于含Poly(A)结构的真核生物mRNA,也适用于不含Poly(A)结构的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板的逆转录,但不适用于miRNA等小RNA模板的逆转录;

    2.20 μL逆转录体系中建议Total RNA的加入量不超过1 μg,若加入RNA过量,可能会抑制逆转录反应;

    3.建议将逆转录得到的cDNA原液稀释5~10倍后再作为qPCR反应的模板,若直接使用cDNA原液作为模板,建议cDNA原液体积不超过qPCR反应体积的1/10;

    4.逆转录产物建议立即用于qPCR反应或保存于-20℃后尽快使用。若需要长期保存,建议于-80℃保存,避免反复冻融。

    使用方法

    • 两步法逆转录流程(适用于基因组DNA含量较高的RNA样品)

    1.基因组DNA去除

    在RNase-Free离心管中配制如下反应液(冰上配制):

    组分

    使用量

    RNA模板*

    50 ng~1 μg

    dsDNase

    1.0 μL

    10×dsDNase Buffer

    1.0 μL

    Nuclease-Free Water

    Up to 10 μL

    *模板:推荐使用试剂盒提取的RNA作为模板。

    用移液器轻轻吹打混匀,瞬时离心后按下列程序进行反应(反应结束后立即置于冰上):

    温度

    时间

    37℃

    2~5 min*

    65℃

    2 min

    *若RNA模板中基因组DNA含量较多,可适当延长37℃孵育时间至5 min。

    2.第一链cDNA合成(冰上配制)

    组分

    使用量

     “第1步”的反应产物

    10 μL

    UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix

    4.0 μL

    Nuclease-Free Water

    Up to 20 μL

    用移液器轻轻吹打混匀,瞬时离心后按下列程序进行反应:

    温度

    时间

    25℃

    10 min*

    50℃

    15 min

    85℃

    5 min

    *当目标RNA不含有Poly(A)结构时,可进行此步骤。

    • 一步法逆转录流程(适用于基因组DNA含量较低的RNA样品)

    在RNase-Free离心管中配制如下反应液(冰上配制):

    组分

    使用量

     RNA模板*

    50 ng~1 μg

    UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix

    4.0 μL

    dsDNase

    1.0 μL

    Nuclease-Free Water

    Up to 20 μL

    *模板:推荐使用试剂盒提取的RNA作为模板。

    用移液器轻轻吹打混匀,瞬时离心后按下列程序进行反应:

    温度

    时间

    37℃

    2 min

    55℃

    15 min

    85℃

    5 min

    常见问题与解决办法

    Q1:逆转录后的cDNA产物进行qPCR检测,CT值偏高?

    A1:

    1.模板 RNA 提取失败或存在降解。建议在逆转录反应前一定要电泳验证 RNA 的完整性,提取RNA 后尽快进行逆转录及 qPCR 操作;

    2.基因表达量较低。可适当提高模板RNA用量;

    3.逆转录体系、程序或加样等操作不当。建议按照说明书规范操作。

    Q2:逆转录后进行 qPCR,熔解曲线非单一峰?

    A2:

    1.RNA 模板中含有 gDNA。建议逆转录前进行去基因组反应或引物跨内含子设计;

    2.qPCR 引物特异性差。重新设计特异性较好的引物,可通过常规 PCR检测引物特异性;

    3.引物过量。引物过量可能形成引物二聚体,建议按说明书推荐用量添加;

    4.体系可能存在污染。设置无模板阴性对照(NTC)检查体系是否存在污染,若存在污染,建议更换试剂及耗材,使用核酸清洁剂清洁(目录号:04.10013)操作台面及实验环境中的气溶胶污染。

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