高脂样本游离胆固醇酶法测定试剂盒


  • 商品名称: 高脂样本游离胆固醇酶法测定试剂盒
  • 产品货号: 02.12955-105
  • 品牌: EallBio/亿奥邦
  • 储存条件: 2-8℃
  • 有效期: 6个月

所属分类:

胆固醇测定系列

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¥ 1350

市场价

¥ 1350

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    • 105T
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  • 产品描述
    • 商品名称: 高脂样本游离胆固醇酶法测定试剂盒
    • 产品货号: 02.12955-105
    • 品牌: EallBio/亿奥邦
    • 储存条件: 2-8℃
    • 有效期: 6个月

    产品简介:

    在实体组织和细胞内,胆固醇酯既是构成细胞质膜的成分,也是细胞内脂滴的主要组分。细胞内胆固醇过度聚集与动脉粥样硬化泡沫细胞形成密切相关。实体组织和细胞的胆固醇测定远比血液胆固醇测定复杂。本试剂盒避免了有毒的有机溶剂抽提、繁杂的氮气吹干和脂质复溶等步骤,采用高效能试剂裂解细胞和提取胆固醇,优化了酶学反应和操作步骤,简单易行,灵敏度高,线性范围20~5000 umol/L。

    本试剂盒测定方法采用 CHOD-PAP 终点方法结合经典 GPO Trinder 酶学反应,其原理为:

       (1)胆固醇氧化酶将游离胆固醇氧化,产生过氧化氢。

       (2)在过氧化物酶催化不生色底物转化为苯醌亚胺,光密度值与胆固醇浓度成正比。

    测定样品范围:脂肪含量较高的动物实体组织、培养细胞

    操作说明(仅供参考):

    一、样本处理:组织细胞裂解:裂解前,组织或细胞用PBS洗涤2次去除残存血液或培养基血清,以免影响胆固醇测定。

    1.培养细胞裂解:消化、离心收集细胞或直接在培养皿内裂解。通常6孔板单孔约 2x106个细胞,75 cm?瓶约 1x10?细胞。按比例每 1x106个细胞加 0.1ml 裂解液,震荡混匀,静置 10 min。

    2.动物组织裂解:切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生严重的测量误差。离心管精确称重,加入组织块后再称重,二者相减(即减量称重法)计算组织重量(约 100mg)。强烈建议按比例每1mg 组织加 10 μ 裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。(注意:裂解液用量在1ml或更多可保证有效的裂解与脂质提取)。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。(不推荐超声方法,因其不能完全和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量),而后静置10min。

    二、组织细胞裂解液处理:

    1.取适量上清液转移到 1.5 m1离心管,进行步骤2的操作。余下的裂解液用亿奥邦生产的 BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定,或-20℃储存。

    2.可选的优化步骤:70°C加热 10 min,可能出现絮状沉淀。(此步骤即可在组织量多、胆固醇含量高时采用)。

    3.室温 2000g离心5min,取上层清液用于酶学测定。

    注意:如果得到上清的上层有较多的白色乳浊样小颗粒,重复步骤2和3。

    三、工作溶液配制:

    按 4:1 比例,取 4mlR1 试剂与 1m R2 试剂混合均匀,立即使用或4℃℃ 保存<1 d,变色弃去。

    四、标准品稀释:

    5 mM 胆固醇标准品用无水乙醇倍比稀释为 2500、1250、625、312.5、156、78、39 μmol。通常稀释4个点/管即可,注意设置0浓度对照反应管。立即使用。

    五、含量测定:

    1.取 190 μl(190~180 μl)工作液。

    2.在各工作液中,分别加入 10 μl(10~20 μ1)空白对照溶液(无水乙醇或蒸馏水均可)、标准品、待测样品,反应总体积 200 μl。

    3.37 ℃C反应 20 min 也可 25 ·C室温反应 30 min 但灵敏度会略微下降。反应平衡后颜色在 60 min内稳定。

    4.测定时,先用蒸馏水(或无水乙醇)+工作液空白对照管调零,然后测定各管 OD 值。最佳工作波长 550-555 nm,如仪器无此波长建议优先选用 570 nm,次选 530、490 nm。

    5.绘制标准曲线并计算总胆固醇浓度。Excel 绘制标准曲线步骤:各标准管 OD值为y轴,标准品浓度为x轴。

    特别注意:

    1.维生素 C>0.18 g工、血红蛋白》2 g、还原剂二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度 EDTA 干扰测试。

    2.不同类型的组织细胞内总胆固醇和游离胆固醇的比例差异很大。延长反应时间可能使游离胆固醇值增加 因而使其值与总胆固醇值接近。由差值计算求得的胆固醇酯的值,主要适合血液样品测定,可能不很适 合细胞内胆固醇酯测定。其原因主要与细胞内胆固醇酯和游离胆固醇的合成、转运.外流、储存、分解、再酯化等诸多动态生物过程的非线性的高度复杂性有关,还与现有测量方法的局限性有关。胆固醇(酯)的含量以及代谢方式在肝细胞、巨细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等不同类型的细胞中存在巨大差异。有时以差值计算的胆固醇酯出现背离和偏差,甚至为负值。如果出现这种情况,建议在数据分析时采用胆固醇酯/总胆固醇比值,而非胆固醇酯绝对值;或者尝试用同位素标记方法、薄层层析、HPLC 等方法测定胆固醇酯,或许会有改善。

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