高脂样本总胆固醇酶法测定试剂盒


  • 商品名称: 高脂样本总胆固醇酶法测定试剂盒
  • 产品货号: 02.12944-105
  • 品牌: EallBio/亿奥邦
  • 储存条件: 2-8℃
  • 有效期: 6个月

所属分类:

胆固醇测定系列

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¥ 1350

市场价

¥ 1350

  • 产品规格
    • 105T
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  • 产品描述
    • 商品名称: 高脂样本总胆固醇酶法测定试剂盒
    • 产品货号: 02.12944-105
    • 品牌: EallBio/亿奥邦
    • 储存条件: 2-8℃
    • 有效期: 6个月

    产品简介:

    在实体组织和细胞内,胆固醇酯既是构成细胞质膜的成分,也是细胞内脂滴的主要组分。细胞内胆固醇过度聚集与动脉粥样硬化泡沫细胞形成密切相关。实体组织和细胞的胆固醇测定远比血液胆固醇测定复杂。本试剂盒避免了有毒的有机溶剂抽提、繁杂的氮气吹干和脂质复溶等步骤,采用高效能试剂裂解细胞和提取胆固醇,优化了酶学反应和操作步骤,简单易行,灵敏度高,线性范围20~5000 µmol/L。

    本试剂盒测定方法采用 CHOD-PAP 终点方法结合经典 GPO Trinder 酶学反应,其原理为:

    1.胆固醇酯酶分解胆固醇酯为游离胆固醇。

    2.胆固醇氧化酶将游离胆固醇氧化,产生过氧化氢。

    3.在过氧化物酶催化下生色底物转化为苯醌亚胺,光密度值与胆固醇浓度成正比。

    测定样品范围:动物实体组织、培养细胞

    操作说明(仅供参考):

    一、样本处理:组织细胞裂解:裂解前,组织或细胞用PBS洗涤2次去除残存血液或培养基血清,以免影响胆固醇测定。

    1. 培养细胞裂解:消化、离心收集细胞或直接在培养皿内裂解。通常6孔板单孔约2 × 106个细胞,75 cm2瓶约1 × 107细胞。按比例每1 × 106个细胞加0.1 ml裂解液,震荡混匀,静置10 min。

    2. 动物组织裂解:切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生严重的测量误差。离心管精确称重,加入组织块后再称重,二者相减(即减量称重法)计算组织重量(约100 mg)。强烈建议按比例每1 mg组织加10 µl裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。(注意;裂解液用量在1 ml或更多可保证有效的裂解与脂质提取)。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。(不推荐超声方法,因其不能完全和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量),而后静置10 min。

    二、组织细胞裂解液处理:

    1. 取适量上清液转移到1.5 ml离心管,进行步骤2的操作。余下的裂解液用亿奥邦生产的BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定,或-20 ℃储存。

    2. 可选的优化步骤:70 ℃加热10 min,可能出现絮状沉淀。(此步骤即可在组织量多、胆固醇含量高时采用)。

    3. 室温2000 g离心5 min,取上层清液用于酶学测定。

    注意:如果得到上清的上层有较多的白色乳浊样小颗粒,重复步骤2和3。

    三、工作溶液配制:

    按4:1比例,取4 ml R1试剂与1 ml R2试剂混合均匀,立即使用或4 ºC保存<1 d,变色弃去。

    四、标准品稀释:

    5 mM胆固醇标准品用无水乙醇倍比稀释为2500、1250、625、312.5、156、78、39 µmol/L。通常稀释4个点/管即可,注意设置0浓度对照反应管。立即使用。

    五、含量测定:

    1. 取190 µl(190~180 µl)工作液。

    2. 在各工作液中,分别加入10 µl(10~20 µl)空白对照溶液(无水乙醇或蒸馏水均可)、标准品、待测样品,反应总体积200 µl。

    3. 37 ℃反应20 min也可25 ℃室温反应30 min但灵敏度会略微下降。反应平衡后颜色在60 min内稳定。

    4. 测定时,先用蒸馏水(或无水乙醇)+工作液空白对照管调零,然后测定各管OD值,最佳工作波长550-555 nm,如仪器无此波长建议优先选用570 nm,次选530、490 nm。

    5. 绘制标准曲线并计算总胆固醇浓度。Excel绘制标准曲线步骤:各标准管OD值为y轴,标准品浓度为x轴。

    6. 以每mg蛋白浓度或细胞数校正胆固醇含量。

    特别注意:

    1.维生素C>0.18 g/L、血红蛋白>2 g/L、还原剂二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。

    2.不同类型的组织细胞内总胆固醇和游离胆固醇的比例差异很大。延长反应时间可能使游离胆固醇值增加 因而使其值与总胆固醇值接近。由差值计算求得的胆固醇酯的值,主要适合血液样品测定,可能不很适 合细胞内胆固醇酯测定。其原因主要与细胞内胆固醇酯和游离胆固醇的合成、转运、外流、储存、分解、再酯化等诸多动态生物过程的非线性的高度复杂性有关,还与现有测量方法的局限性有关。胆固醇(酯)的含量以及代谢方式在肝细胞、巨噬细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等不同类型的细胞中存在巨大差异。有时以差值计算的胆固醇酯出现背离和偏差,甚至为负值。如果出现这种情况,建议在数据分析时采用胆固醇酯/总胆固醇比值,而非胆固醇酯绝对值;或者尝试用同位素标记方法、薄层层析、HPLC等方法测定胆固醇酯,或许会有改善。

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