亚铁氧化酶(HP)活性检测试剂盒


  • 商品名称: 亚铁氧化酶(HP)活性检测试剂盒
  • 产品货号: 02.13075-100
  • 品牌: EallBio/亿奥邦
  • 储存条件: 2-8 ℃保存
  • 有效期: 1年

所属分类:

抗氧化系列

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¥ 2118

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¥ 2118

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  • 产品描述
    • 商品名称: 亚铁氧化酶(HP)活性检测试剂盒
    • 产品货号: 02.13075-100
    • 品牌: EallBio/亿奥邦
    • 储存条件: 2-8 ℃保存
    • 有效期: 1年

    产品简介:

    亚铁氧化酶(Hsphasetin,HP)是铜蓝蛋白的同系物,催化亚铁离子(Fe2+)氧化为三价铁离子(Fe3+),从而三价铁与转铁蛋白结合,参与细胞铁释放。以一定浓度的 Fe2+为底物,在亚铁氧化酶的催化作用下F2+被氧化为Fe3+,Fe2+与菲咯嗪形成有色复合物,在 540nm 处有特征吸收峰,先计算出未被氧化的Fe2+的含量,进而得出被氧化的 Fe2+的含量,可通过Fe2+被氧化的速率来反映亚铁氧化酶活性。

    注意:实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

    需自备的仪器和用品:酶标仪、96孔板、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。

    操作说明(仅供参考):

    一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

    1.组织:按照质量(g):蒸馏水体积(ml)为1:5~10的比例)(建议称取约 0.1g,加入1ml蒸馏水)加入蒸馏水,冰浴匀浆后于10000rpm,4°C离心10min,取上清置于冰上待测。

    2.血清或血浆:建议用蒸馏水将血清或血浆稀释2~4倍后直接检测。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。

    二、测定步骤

    1.酶标仪预热30min 以上,调节波长至 540 nm。

    2.标准液的稀释: 将9μmol/ml的亚铁离子标准液用蒸馏水倍比稀释为 360、180、90、45、22.511.25、5.625 nmolml的标准溶液备用。
    标准液稀释可参考下表:

    序号 稀释前浓度(nM/ml) 标准液体积(μl) 蒸馏水体积(μl) 稀释后浓度(nM/ml)
    1 9000 40 960 360
    2 360 500 500 180
    3 180 500 500 90
    4 90 500 500 45
    5 45 500 500 22.5
    6 22.5 500 500 11.25
    7 11.25 500 500 5.625

    备注:实验中每个标准管需40m标准溶液

    4.操作表:在1.5ml离心管96孔板中依次加入下列试剂:

    试剂名称 对照管 测定管 无基质管 空白管 标准管
    蒸馏水(μl) - - 8 8 8
    样本 8 8 - - -
    试剂一 112 112 112 112 112
    用移液枪充分吹打均匀
    试剂二 - 40 40 - -
    标准溶液 - - - - 40
    蒸馏水 40 - - 40 -
    混匀,37℃水浴锅或恒温培养箱中准确反应3min
    试剂三 40 40 40 40 40
    混匀,于 96孔板中测定 540nm 处吸光值 A,分别记为A对照管,A 测定管、A 无基质管、A空白管和A标准管。计算AA测定=(A无基质管-A空白管)-(A测定管-A 对照管),AA 标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管,同一批次无基质管、空白管和标准管只需测1-2次。

    三、亚铁氧化酶活性计算

    1.标准曲线的绘制:以各个标准溶液的浓度(nmol/ml)为x轴,其对应的AA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将△A测定带入方程得到样本浓度(x,nmol/ml)。

    2.亚铁氧化酶活性的计算:

    (1)按照样本蛋白浓度计算

    酶活定义:每mg蛋白每分钟氧化1nmol的Fe2+定义为1个酶活力单位。

    亚铁氧化酶酶活(U/mg prot)=xxV 试剂二÷(V 样xCpr)÷TxN=1.667x÷CprxN

    (2)按照样本质量计算

    酶活定义:每g样品每分钟氧化1nmol的Fe2定义为1个酶活力单位。

    亚铁氧化酶酶活(U/g 鲜重)=xxV 试剂二÷(V 样xW÷V 提取)÷TxN=1.667x÷WxN

    (3)按液体体积计算

    酶活定义:每m1样本每分钟氧化1nmol的Fe2+定义为1个酶活力单位。亚铁氧化酶酶活(U/m1)=xxV 试剂二÷V样÷TxN=1.667xxNV 试剂二:加入的试剂二体积,0.04m;V样:加入的样本体积,0.008ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:3min;N:稀释倍数。

    注意事项:

    当A测定低于0.1时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数

    实验实例:

    1.取 0.1g结肠,进行样本处理,按照测定操作步骤,测得计算AA 测定=(A无基质管-A空白管)-(A 测定管-A 对照管)=(1.144-0.041)-(1.114-0.048)=0.037,带入标准曲线 y=0.0031x-0.0007,计算 x=11.710,按照样本质量计算酶活得:亚铁氧化酶酶活(U/g质量)=1.667xx÷WxN=1.667x11.710-0.1=195.161 U/g 质量。

    2.取兔血清,按照测定操作步骤,测得计算AA 测定=(A 无基质管-A空白管)-(A测定管-A对照管)=(0.577-0.048)-(1.114-0.048)=0.574,带入标准曲线y=0.0031x-0.0007,计算x=184.935,按照液体体积计算酶活得:亚铁氧化酶酶活(U/ml)=1.667xx=1.667x184.935=308.287 U/m1

    附录:

    标准品浓度(nmol/ml) 360 180 90 45 22.5 11.25 5.625
    吸光度 0.928 0.472 0.251 0.141 0.0803 0.0593 0.044

     

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