Lipofect脂质体转染试剂


  • 商品名称: Lipofect脂质体转染试剂
  • 产品货号: 03.17001DA
  • 品牌: EallBio/亿奥邦
  • 储存条件: 2-8℃
  • 有效期: 1年

所属分类:

细胞实验相关试剂

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  • 产品描述
    • 商品名称: Lipofect脂质体转染试剂
    • 产品货号: 03.17001DA
    • 品牌: EallBio/亿奥邦
    • 储存条件: 2-8℃
    • 有效期: 1年

    产品简介:

    Lipofect脂质体转染试剂(一下简称“Lipofect”)为亿奥邦最新研发的一种以纳米材料为基础的便捷高效细胞转染试剂,达到甚至超过了国际主流转染试剂的转染效果。适用于把外源DNA、RNA、siRNA转入各类细胞,能转染贴壁细胞、悬浮细胞,还可以用于siRNA和shRNA的基因敲除实验及基因表达研究。

    Lipofect转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、通常观察不到细胞毒性,对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用,特别适用于难转染的贴壁细胞。Lipofect转染试剂由于通常没有明显的细胞毒性,从而在转染后无需进行细胞培养液的更换,在转染24-48小时后直接收集细胞进行蛋白表达鉴定即可。

    操作步骤:

    1. DNA转染(以6孔板为例,其他可参考6孔板):

    (1)细胞准备:转染前一天(18~24 h)用胰酶消化、铺板,转染当天细胞汇合度达到70%~90%,保证活细胞>90%。转染之前,把培养有细胞的六孔板每孔换成2 ml不含血清和抗生素培养液。

    (2)准备DNA-Lipofect复合物(具体信息参考表1):

    a. 取一支无菌EP管,加入125 μl不含抗生素和血清的MEM细胞培养液(Opti-MEM或Ultra-MEM 03.18001),然后加入待转DNA或质粒,确保最终DNA量为2.5 μg,轻微吹吸使混和均匀(请特别注意不可Vortex或离心)。

    b. 取一支无菌EP管,加入125 μl不含抗生素和血清的MEM细胞培养液(Opti-MEM或Ultra-MEM 03.18001),然后加入Lipofect转染试剂5 μl,轻微吹吸使混和均匀(请特别注意不可Vortex或离心)。

    c. 分别吸取将上述含有DNA的培养液加入稀释好的Lipofect的EP管中,轻轻吹打、晃动使混和均匀(请特别注意不可Vortex或离心),室温静置20 min形成DNA-Lipofect复合物(室温条件6 h内性质稳定)。

    (3)转染细胞:无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,按照每空250 μl DNA-Lipofect复合物中逐滴分散加入到孔内,轻微晃动。

    (4)细胞换液:为达到最高的转染效率,细胞在转染后培养4~6小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Hela细胞,推荐在转染4小时后更换培养液,对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞,推荐在转染6小时后更换培养液)。

    (5)细胞检测:加入DNA-Lipofect复合物的细胞继续培养约24~48小时后,即可用适当方式检测转染效果,例如荧光检测、Western Blot、ELISA、报告基因等,或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。

    表1:不同培养体积对应的待转DNA、Lipofect、Ultra-MEM用量

    培养皿

    96孔板

    48孔板

    24孔板

    12孔板

    6孔板

    6 cm皿

    10 cm皿

    推荐转染质粒总量/μg

    0.1

    0.25

    0.5

    1

    2.5

    5

    15

    无血清培养基或Ultra-MEM/μl

    5

    12.5

    25

    50

    125

    250

    500

    转染试剂/μl

    0.12

    0.5

    1

    2

    5

    10

    30

    无血清培养基或Ultra-MEM/μl

    5

    12.5

    25

    50

    125

    250

    500

    稀释好的Lipofect和DNA分别室温静止放置5分钟,随后两者混合并混匀再室温静止放置20分钟

    每孔加入的混合物的量/μl

    10

    25

    50

    100

    250

    500

    1000

    按照上述用量每孔均匀滴加DNA-Lipofect复合物,4-6小时后更换培养液或直接继续培养

    注1:对于六孔板中一个孔的细胞,Lipofect的用量可以在3-10 μl范围内进行适当调节,DNA用量建议固定在2.5 μg,但也可以在1-4 μg的范围内进行适当调节。通常质粒用量(μg)和Lipofect(μl)的用量比例为1:2或1:3比较常用,如有必要可以在1:0.5~1:5的范围内优化转染效果,上表推荐的比例为1:1.2,此时Lipofect的用量相对较少,既经济又高效。最佳的转染条件,因不同的细胞类型和培养条件而有所不同,可以在上述推荐范围自行优化转染条件。

    注2:质粒的浓度宜控制在0.5-5 μg/μl范围内。

    注3:对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的Lipofect和DNA混合物分别配制,然后一起混合在同一个离心管内,后续混匀并孵育5分钟后,可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。

    注4:对于其它培养板或培养器皿,各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。

    2. siRNA转染(以6孔板为例,其他可参考6孔板):

    (1)细胞准备:转染前一天(18~24 h)用胰酶消化、铺板,转染当天细胞汇合度达到70%~90%,保证活细胞>90%。转染之前,把培养有细胞的六孔板每孔换成2 ml不含血清和抗生素培养液。

    (2)准备复合物(具体信息参考表2):

    a. 取一支无菌EP管,加入125 μl不含抗生素和血清的MEM细胞培养液(或Opti-MEM),然后加入待转siRNA,确保最终DNA量为100 pmol,轻微吹吸使混和均匀(请特别注意不可Vortex或离心)。

    b. 取一支无菌EP管,加入125 μl不含抗生素和血清的MEM细胞培养液(或Opti-MEM),然后加入Lipofect转染试剂5 μl,轻微吹吸使混和均匀(请特别注意不可Vortex或离心)。

    c. 分别吸取将上述含有siRNA的培养液加入稀释好的Lipofect的EP管中,轻轻吹打、晃动使混和均匀(请特别注意不可Vortex或离心),室温静置20 min形成复合物(室温条件6 h内性质稳定)。

    (3)转染细胞:无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,按照每空250 μl复合物中逐滴分散加入到孔内,轻微晃动。

    (4)细胞换液:为达到最高的转染效率,细胞在转染后培养4~6小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Hela细胞,推荐在转染4小时后更换培养液,对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞,推荐在转染6小时后更换培养液)。

    (5)细胞检测:继续培养3-5天后,即可用适当方式检测siRNA对于靶基因的下调效果,例如qPCR、Western、ELISA、报告基因等。

    表2:不同培养体积对应的待转siRNA、Lipofect、Ultra-MEM用量

    培养皿

    96孔板

    48孔板

    24孔板

    12孔板

    6孔板

    6 cm皿

    10 cm皿

    siRNA

    4

    10

    20

    40

    100

    200

    600

    无血清培养基或Ultra-MEM/μl

    5

    12.5

    25

    50

    125

    250

    500

    转染试剂/μl

    0.2

    0.5

    1

    2

    5

    10

    30

    无血清培养基或Ultra-MEM/μl

    5

    12.5

    25

    50

    125

    250

    500

    稀释好的Lipofect和siRNA分别室温静止放置5分钟,随后两者混合并混匀再室温静止放置20分钟

    每孔加入的混合物的量/μl

    10

    25

    50

    100

    250

    500

    1000

    按照上述用量每孔均匀滴加复合物,4-6小时后更换培养液或直接继续培养

    注1:对于六孔板中一个孔的细胞,Lipofect的用量可以在2.5-7.5 μl范围内进行适当调节,siRNA用量可以在50-250 pmol的范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和Lipofect的用量比例为20:1,如有必要可以在10:1-40:1的范围内优化转染效果,上表推荐的比例为20:1,此时Lipofect的用量相对较少,既经济又高效。最佳的转染条件,因不同的细胞类型和培养条件而有所不同,可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。

    注2:siRNA的推荐浓度为20 µM,常用的浓度范围为10-50 µM。

    注3:对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的Lipofect和siRNA混合物分别配制,然后一起混合在同一个离心管内,后续混匀并孵育5分钟后,可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。

    注4:对于其它培养板或培养器皿,各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。

    注意事项:

    1. 本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。

    2. 由于双抗会影响重组蛋白的表达,为获得最佳表达效果,建议在细胞转染前2 h更换成不含抗生素和血清的培养基,在转后4-6 h换回含抗生素和血清的培养基。

    3. 质粒质量:请务必使用高质量转染级无内毒素质粒。通过260 nm光吸收测定DNA浓度,260nm/280nm比值确定DNA纯度(比值应该在1.8~1.9的范围之内)。如有可能,请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。

    4. 细胞条件:使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保培养基没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞,请在转染前至少传代两次。建议使用GIBCO或者亿奥邦的特级胎牛血清(货号:03.U16001DC)培养细胞。

    5. 为了减少操作误差,上述操作步骤设定一个重复平行样,用户可根据实验室目的和实验室条件调整。

    6. 贴壁细胞转染时状态良好,细胞密度达30-50%时才可进行转染,过稀可能影响转染效率,细胞密度达到50~90%时通常不会影响转染效率。不同细胞的最佳转染密度需要自行摸索。悬浮细胞宜在对数生长期进行转染。

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