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一、产品简介：
亿奥邦生产的EA Trans细胞转染试剂（低毒）是一种经过优化改造后的DNA转染方法，采用细胞生理吸收机制，具有高效转染、转染过程极其温和和可重现性卓越等优势。本产品纯化学合成，不含动物源成分，特别适合多质粒的共同转染，用于重组病毒载体的生产，以及重组蛋白的瞬时表达生产。本产品细胞毒性低、转染效率高、兼容抗生素。在HEK293等细胞中基因表达效率较高。
二、操作步骤：
1. 贴壁细胞（6孔板为例）
（1）细胞准备：转染前一天用胰酶消化、铺板，转染当天细胞汇合度达到70%-80%，保证活细胞>90%。
（2）准备复合物（具体信息参考表1）
a. 质粒与试剂比例：建议质粒（μg）与试剂（μl）参考配比区间为1:2至1:6。
b. 质粒稀释：使用125 μl无抗生素和血清培养基（Opti-MEM）稀释2.5 μg质粒，并轻轻混匀。
c. EA Trans转染试剂稀释：使用125 μl无血清培养基（Opti-MEM）稀释5 μl EA Trans转染试剂，并轻轻混匀。
d. 配置复合物：将配置好的125 μl转染试剂稀释液加入到125 μl质粒稀释液中，轻轻涡旋混匀后，室温静置10-20 min，形成EA Trans-DNA复合物，备用。
（3）转染细胞：按照每空250 μl复合物中逐滴分散加入到孔内，轻微晃动。
（4）细胞换液：为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养4~6小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Hela细胞，推荐在转染4小时后更换培养液，对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞，推荐在转染6小时后更换培养液)。
（5）细胞检测：加入复合物的细胞继续培养约24~48 h后，即可用适当方式检测转染效果，例如荧光检测、Western Blot、ELISA、报告基因等，或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。
表1：不同培养体积对应的待转DNA、EA Trans、稀释液用量
|
培养皿 |
96孔板 |
48孔板 |
24孔板 |
12孔板 |
6孔板 |
6 cm皿 |
10 cm皿 |
|
推荐转染质粒总量/μg |
0.1 |
0.25 |
0.5 |
1 |
2.5 |
5 |
15 |
|
无血清培养基或Ultra-MEM/μl |
5 |
12.5 |
25 |
50 |
125 |
250 |
500 |
|
转染试剂/μl |
0.12 |
0.5 |
1 |
2 |
5 |
10 |
30 |
|
无血清培养基或Ultra-MEM/μl |
5 |
12.5 |
25 |
50 |
125 |
250 |
500 |
|
稀释好的EA Trans和DNA两者混合并混匀室温静止放置20分钟 |
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每孔加入的混合物的量/μl |
10 |
25 |
50 |
100 |
250 |
500 |
1000 |
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按照上述用量每孔均匀滴加DNA-Lipofect复合物，4-6小时后更换培养液或直接继续培养 |
|||||||
2.悬浮细胞（以293FT细胞、1 ml培养体积为例）
（1）细胞准备：根据细胞状态，选择合适的接种密度，建议细胞接种密度为1-1.5×106 cells/ml，使第二天转染时细胞密度为2~3×106 cells/ml为宜。
（2）准备EA Trans-DNA复合物
a. 质粒与试剂比例：建议质粒（μg）与试剂（μl）参考配比区间为1:2-1:6。
b. 质粒稀释：使用50 ml无血清培养基（Opti-MEM）稀释2 mg质粒，并轻轻混匀。
c. 试剂稀释：使用48 ml无血清培养基（Opti-MEM）稀释2 ml EA Trans转染试剂，并轻轻混匀。
d. 配置复合物：将配置好的50 ml转染试剂稀释液加入到50 ml质粒稀释液中，轻轻涡旋混匀后，室温静置10-20 min，形成EA Trans-DNA复合物，备用。
（3）转染细胞：直接将100 ml的EA Trans-DNA复合物加入1 L培养的细胞中。
（4）细胞检测：加入EA Trans-DNA复合物的细胞继续培养约24~48小时后，即可用适当方式检测转染效果，例如荧光检测、Western Blot、ELISA、报告基因等，或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。
三、注意事项
1. 本品需采用冰袋运输，2~8℃保存，有效期1年。
2. 为提高转染效率，建议悬浮细胞在无血清培养体系中驯化几天后进行转染操作。
3. 转染过程中推荐使用高质量的质粒，如不含内毒素的质粒。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5. 本产品仅用于科研用途。
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